Molekularbiologie
Die Molekularbiologie als Teilbereich der Umweltmikrobiologie beschäftigt sich in unserem Labor mit der genetischen Analyse von Bakterien aus Oberflächenwasser- und Abwasserproben. Zunächst werden in einem kulturellen Ansatz die in der Probe enthaltenen Bakterien auf einem festen Nährmedium kultiviert. Zum Nachweis von Antibiotikaresistenten Bakterien verwendet man hierfür verschiedene Selektivnährmedien. Nachfolgend werden Reinkulturen isoliert. Die Bakterien aus diesen Reinkulturen können anschließend molekularbiologisch z. B. mittels Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, PCR) oder über eine Ganzgenomsequenzierung hinsichtlich ihrer Spezies oder ihrer Resistenzgene charakterisiert werden.
Eines der Ziele ist dabei die NRW-weite Überwachung des aktuellen Vorkommens antibiotikaresistenter Bakterien in Oberflächengewässern inklusive Badegewässern und in Abwasserbehandlungsanlagen sowie Abwasserableitungen. Zusätzlich identifizieren wir Eintrittspunkte und Kontaminationspfade der hygienerelevanten Mikroorganismen in unsere aquatische Umwelt. Diese Surveillance (Überwachung) der Mikroorganismen wird dabei über ein standardisiertes und periodisches Oberflächenwasser- und Abwassermonitoring erreicht.
Bei der Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, PCR) werden kurze DNA-Abschnitte enzymatisch und unter Zuhilfenahme von Oligonukleotiden, sogenannten Primern, gezielt amplifiziert (vervielfältigt). Primer sind kurze DNA-Fragmente, die komplementär zu randständigen Teilbereichen der zu untersuchenden DNA-Abschnitte sind und die Position bestimmen, an der die DNA-Polymerase die Vervielfältigung der DNA beginnt. Die Länge dieser DNA-Bereiche lässt sich durch die Wahl der Oligonukleotide frei variieren, umfasst aber meist dreistellige bis kleine vierstellige Basenpaar-Bereiche. Mit dieser Methode werden somit meist einzelne Gene oder kurze DNA-Abschnitte vervielfältigt. Diese können im Anschluss sequenziert werden (z. B. über eine Sanger-Sequenzierung). Dadurch wird jedoch nur ein begrenzter Überblick über einen sehr kleinen Teil eines Genoms ermöglicht. In unserem Labor wird diese Methode unter anderem genutzt, um Varianten von Antibiotikaresistenz-vermittelnden Genen zu identifizieren.
Im Gegensatz zu bisherigen Sequenzierungsverfahren, wie z. B. der Sanger-Sequenzierung, können beim Next-Generation Sequencing (NGS) Verfahren parallel viele Millionen kurzer DNA-Abschnitte sequenziert werden. Es handelt sich dabei also um eine Hochdurchsatztechnologie. Mit dieser Methode können mehrere vollständige Bakteriengenome simultan sequenziert werden.
Dabei werden kurze Sequenz-Abschnitte (Reads) erzeugt, die sich gleichmäßig über das Bakteriengenom verteilen und alle Gene eines Isolates mitsamt aller vorhandenen, z.B. resistenzvermittelnden-Gene abdecken, was auch als Ganzgenomsequenzierung (Whole Genome Sequencing, WGS) bezeichnet wird. Aus diesen Sequenz-Abschnitten wird das Genom des Bakteriums rekonstruiert und ein Datenbankabgleich vom Kerngenom und von erworbenen Genen durchgeführt. Die Ganzgenomsequenzierung ermöglicht somit die Typisierung von bakteriellen Umweltisolaten inklusive der Identifizierung von Hoch-Risiko Klonen. Bei den Hoch-Risiko-Klonen handelt es sich um Bakterien bestimmter Sequenztypen, die weltweit stark verbreitet sind. Auf Grund ihres genetischen Repertoires zeigen sie erhöhte Resistenzen gegenüber Antibiotika und/oder eine gesteigerte Virulenz und sind damit besonders gut in der Lage sich weiter zu verbreiten, Menschen zu kolonisieren und potentiell Infektionen zu verursachen.
Zudem können durch die Ganzgenomsequenzierung Verwandtschaftsverhältnisse einzelner Isolate zueinander analysiert werden, was bei der Überprüfung der Persistenz von Bakterienisolaten in z. B. Kläranlagen von entscheidender Bedeutung sein kann.
Ein weiterer Ansatz des Oberflächenwasser- und Abwassermonitorings ist die digitale PCR (digital Polymerase Chain Reaction, dPCR). Hierfür wird das gesamte genetische Material einer Wasserprobe isoliert und spezifische Nukleinsäuresequenzen, z. B. resistenzvermittelnde Gene, darin quantifiziert, um deren Abundanzen (Häufigkeit) festzustellen. Der Unterschied zu einer herkömmlichen qPCR liegt hierbei in der Präzisionsleistung. Während bei einer qPCR die Quantifizierung durch die Relation zu mitgeführten Standards erfolgt, kommt die dPCR ohne diese aus und bestimmt direkt die An- oder Abwesenheit von DNA-Molekülen und wodurch sich deren Anzahl in einem untersuchten Probenvolumen berechnen lässt. Für diese Methode wird die Probe anfänglich stark verdünnt, was die dPCR weniger anfällig gegenüber PCR-Inhibitoren macht; PCR-Inhibitoren können den Nachweis von Zielgenen deutlich erschweren oder sogar unmöglich machen.
Eine genaue Zuordnung von Resistenzgenen zu einzelnen Bakterienspezies ist mit dieser Methode zwar nicht möglich, aber es werden die Kopienzahlen einzelner Zielgenmoleküle in einer Probe ermittelt. Die Anzahl der nachgewiesenen Zielgenmoleküle kann mit den Daten anderer Probenahmezeitpunkte bzw. Probenahmestellen verglichen werden. Dadurch lässt sich eine Aussage über die zeitliche und räumliche Veränderung der Belastung, z. B. mit Antibiotikaresistenz-vermittelnden Genen oder mit bestimmten Bakterien- oder Virenarten, treffen.
Externer Inhalt
Schutz Ihrer Daten
An dieser Stelle haben wir den Inhalt eines Drittanbieters, bspw. YouTube, X, Instagram etc., eingebunden. Bitte bestätigen Sie über den Button, dass Sie damit einverstanden sind, diese Inhalte zu sehen!
Ich bin damit einverstanden, dass mir externe Inhalte angezeigt werden. Damit können personenbezogene Daten an Drittplattformen übermittelt werden. Mehr dazu in unserer Datenschutz.
